ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ОВЦЕМАТОК КАЗАХСКОЙ МЯСО- ШЕРСТНОЙ ПОРОДЫ ПО ЛОКУСАМ ГЕНОВ GDF9 И BMP15, АССОЦИРОВАННЫХ С РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИЕЙ

GENOTYPING OF KAZAKH MEAT-WOOL BREED EWES AT GDF9 AND BMP15 GENE LOCUSES ASSOCIATED WITH REPRODUCTIVE FUNCTION

Nurzhan Zhadiger

Master’s student, Department of Obstetrics, Surgery and Biotechnology of Reproduction, NJSC Kazakh National Agrarian Research University,

Republic of Kazakhstan, Almaty

 Meruyert Alimbekova

Candidate of Veterinary Sciences, Department of Obstetrics, Surgery and Biotechnology of Reproduction, Associate Professor, Kazakh National Agrarian Research University,

 Republic of Kazakhstan, Almaty

Nazym Akimzhan

Candidate of Agricultural Sciences, Department of Obstetrics, Surgery and Biotechnology of Reproduction, Senior Lecturer, NJSC Kazakh National Agrarian Research University,

 Republic of Kazakhstan, Almaty

Yessengali Ussenbekov

Candidate of Biological Sciences, Department of Obstetrics, Surgery and Biotechnology of Reproduction, Professor, Kazakh National Agrarian Research University,

Republic of Kazakhstan, Almaty

АННОТАЦИЯ

В статье приводятся  результаты генотипирования овцематок казахской мясо-шерстной породы в количестве 65 голов по локусам генов GDF9, BMP15, аллели которых оказывают влияние на репродуктивную функцию овец. По локусу гена GDF9 у исследуемой группы животных не вывялен генетический  полиморфизм, т.е. все образцы ДНК оказались с гомозиготным АА генотипом. Данный факт указывает, что в результате селекционной работы у животных нарушено генное равновесие, все особи имели только гомозиготный генотип. По локусу гена BMP15 у казахской мясо-шерстной породы был выявлен полиморфизм и были вывялены все три генетические варианты: CC, CG, GG генотипы. В настоящее время проводится биоинформационный анализ результатов генотипирования с целью определения ассоциативного влияния аллелей обоих генов на воспроизводительную функцию овец. 

ABSTRACT

The article presents the results of genotyping 65 ewes of the Kazakh meat and wool breed for the GDF9, BMP15 gene loci, the alleles of which affect the reproductive function of sheep. No genetic polymorphism was identified at the GDF9 gene locus in the studied group of animals, i.e. all DNA samples turned out to have the homozygous AA genotype. This fact indicates that as a result of selection work in animals, the gene balance was disturbed; all individuals had only a homozygous genotype. Polymorphism was identified at the BMP15 gene locus in the Kazakh meat and wool breed and all three genetic variants were identified: CC, CG, GG genotypes. Currently, a bioinformatic analysis of genotyping results is being carried out in order to determine the associative influence of alleles of both genes on the reproductive function of sheep.

Ключевые слова: казахская мясо-шерстная порода овец, GDF9, BMP15, SNP, ПДРФ, генотипирование

Keywords: Kazakh meat and wool sheep breed, GDF9, BMP15, SNP, RFLP, genotyping

Введение. В последнее время для прогнозирования репродуктивных показателей использует генотипирование овец по локусам генов,  BMP-15, GDF-9, BMPR-IB, ассоцированные с воспроизводительной способностью. По результатам исследования установлен, что по локусу гена BMP-15 у овец романовской породы выявлен генетический полиморфизм, распределение генотипов у овец было следующим образом: WW - 25%, WM - 75 и MM - 0%, у баранов баранов - 0%, 80% и 20%, соответственно [1]. В другой работе изучен ДНК полиморфизм в 1 экзонной части гена GDF9 у овец Египетской породы. Идентификация аллелей изучаемого гена проведена методом ПЦР-ПДРФ анализа с использованием эндонуклеаз - Pst1 или Msp1 [2]. Более фундаметальные исследования были проведены на овцах уотишской породы, которые разводятся в пустынных климатических условиях, определен уровень генетического разнообразия по локусам следующих генов: BMP15, FecXB, FecXG, FecXH, FecXI, GDF9. Полученные предварительные результаты свидетельствуют, что аллели генов GDF9, BMP15, FecXG оказывают некоторое положительное влияние на плодовитость и фертильность у овец [3].

Целью настоящего исследования было проведение генотипирование методом ПЦР-ПДРФ анализа овцематок казахской мясо-шерстной породы по локусам генов GDF9, BMP15, аллели которых оказывают влияние на репродуктивную фунцию.

Материалы и методы исследования. В нашей работе в качестве материала для выделения ДНК была использована периферическая кровь. Генотипирование проводилось на 65 овцематках казахской мясо-шерстной породы, кровь для исследования брали из яремной вены в ваккумную пробирку с ЭДТА. Изоляция ДНК была осуществлена классическим фенольным методом, генотпирование образцов ДНК проводили по двум локусам генов GDF9 и BMP15 с использованием праймеров. Праймеры для идентификации аллелей гена GDF9 прямые F-5′- GAAGACTGGTATGGGGAAATG -3′ и обратные R-5′- CCAATCTGCTCCTACACACCT- 3′, температура отжига праймеров - 58°C, используемая рестриктаза HhaI, размер амплификата 141 bp, для аллелей гена BMP15 - F-5′- CACTGTCTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC-3′ и обратные R-5′-GATGCAATACTGCCTGCTTG- 3′, температура отжига праймеров - 66°C, используемая рестриктаза Hinf1, размер амплификата 462 bp. Амплификацию нужного фрагмента гена проводили на амплификаторе «Эффендорф» (Германия) согласно температурному режиму.

Результаты и их обсуждение. Были оптимизированы условия проведения амплификации, размер ПЦР продукта гена GDF9 имел размер 141 п.н. (рис 1), для определения генетических вариантов была использована эндонуклеаза Hinf1 с сайтом рестрикции G/ACT, в зависимости от генотипа после рестрикции образуются фрагменты: у гомозиготных AA генотипом - 112 п.н. и 29 п.н., у гетерозиготных GA генотипом - 141 п.н., 112 п.н., 29 п.н., у гомозиготных GG генотипом - 141 п.н. (рис 2)

Рисунок 1. Электрофореграмма амплификата гена GDF9, агароза 4%, размер ПЦР продукта 141 п.н. М-маркер молекулярных масс 100 bp, лунки – 25-43 – образцы ДНК

Рисунок 2. Электрофореграмма фрагмента гена GDF9 после рестрикции Hinf1, агароза 4%, овцы с гомозиготным AA генотипом, размеры фрагментов 112 п.н., 29 п.н., М- маркер молекулярных масс 100 bp, лунки – 1-19, генотип AA (112 п.н., 29 п.н.)

По локусу гена BMP15 размер амплификата был 462 п.н., для генотипирования была использована рестриктащза Hha1 с сайтом узнавания GCG↑C. На электрофореграмме после рестрикции эндонуклеазой Hha1 появляются фрагменты: 52 п.н., 156 п.н. и 254 п.н., которые позволяют идентифицировать генетические варианты у исследуемых животных.

Выводы. У овец казахской мясо-шерстной породы не выявлен генетический полиморфизм по локусу гена GDF9 (SNP G-A), все протестированные 65 овец имели гомозиготный AA генотипом, что свидетельствует о нарушений генного равновесия у исследуемой группы животных.

Список литературы:

1. Климанова Е.А., Коновалова Т.В.  Полиморфизм локуса BMP-15 у овец романовской породы в условиях Западной Сибири. «Вестник НГАУ» - 2 (67)/2023 стр 197- 204.
2. Zaki A. El Fiky & Gamal M. Hassan & Mohamed I. Nassar. Genetic polymorphism of growth differentiation factor 9 (GDF9) gene related to fecundity in two Egyptian sheep breeds. Assist Reprod Genet (2017) 34:1683–1690
3. Sara E. Ibrahim Mohamed, Romaz M. Ahmed, Khaleel I. Z. Jawasreh, M. A. M. Salih, Dalia Mursi Abdelhalim, A. W. Abdelgadir, Md. T. Obeidat, L. M. A. Musa and Mohammed-Khair A. Ahmed. Genetic polymorphisms of fecundity genes in Watish Sudanese desert sheep. Vet World. 2020 Apr; 13(4): 614–621.